摘要：目的　探讨清热祛湿凉茶对脾胃湿热证大鼠的治疗作用及其可能的作用机制。方法　将 40 只 SD 雄性 大鼠随机分为 5 组：正常对照组，脾胃湿热证模型组，清热祛湿凉茶高剂量、中剂量和低剂量组，每组 8 只 动物。采用高脂高糖饮食、高温高湿环境联合生物致病因子（1×109 cfu·mL － 1 鼠伤寒沙门氏菌）构建脾胃湿 热证模型，并监测大鼠的体重、肛温、饮水和饮食量及一般状况。造模成功后，灌胃给药 1 周，末次给药后 禁食 12 h 后，取血检测大鼠血脂、血糖水平以及血清中一氧化氮（NO）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛 （MDA）含量，HE 染色观察结肠、胃和舌组织病理学形态变化，同时用 Western blot 法检测结肠中核转录因 子 E2 相关因子 2（Nrf2）和血红素氧合酶 1（HO-1）的表达水平。结果　与正常组比较，模型组大鼠的血脂 水平和血清中的 MDA 含量显著升高（P ＜ 0.001），而血清中的 NO 和 SOD 显著下降（P ＜ 0.001），HE 染色 观察结肠、胃和舌组织病理形态有明显炎症改变，结肠组织中 Nrf2 和 HO-1 蛋白表达明显上调（P ＜ 0.001）； 与模型组比较，清热祛湿凉茶低、中、高剂量组均能显著降低脾胃湿热证大鼠肛温（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）， 中、高剂量组能显著降低血清中 MDA 含量（P ＜ 0.001），升高血清中 NO 含量（P ＜ 0.001），高剂量组能升 高血清中 SOD 含量（P ＜ 0.05）组织病理形态也有明显改善，Nrf2 和 HO-1 的表达进一步升高，并在高剂量 时差异具有统计学意义（P ＜0.01，P ＜0.001）。结论　清热祛湿凉茶能够显著改善脾胃湿热证模型大鼠症状， 其作用机制可能与通过激活 Nrf2/HO-1 通路，提高机体抗氧化能力、降低氧化应激的损伤有关。 关键词：脾胃湿热证；氧化应激；Nrf2；HO-1；清热祛湿凉茶。

　脾胃湿热证是湿热蕴结脾胃，致脾失健运胃失和 降而形成的证候，是脾胃实证中的常见证型 [1]。病因 多为外感湿热之邪，过食肥甘厚腻，好发于长夏季节。 脾胃湿热证所涉及的西医病种与消化系统疾病最为密 切 [2]。现代研究表明，湿热证人群和模型动物体内存在 不同程度的自由基损伤，氧化应激可能是其重要的致 病因素之一 [3-5]。机体的氧化应激过程几乎都与 Nrf2 通 路有关 [6]。Nrf2 是核转录因子家族成员之一，在活性 氧（ROS）的作用下可以调控一系列启动子区域有 ARE （antioxidant responsive elements）的抗氧化酶类基因（如 HO-1），进而发挥抗氧化应激作用 [7]。目前还尚未有脾 胃湿热证与 Nrf2/ARE 信号通路相关的研究报道。 　　历史上岭南为疠瘴之地，多雨潮湿。而其饮食文化 较为丰富，喜食海鲜、禽类，这样的气候及饮食习惯也 影响了人们的体质，多表现为湿热、阴虚、痰湿体质 [8]。 先民们为了除湿去热，适应环境，遂采集一些清热解毒、 消暑去湿的草药，经过一些具有中医药知识的人长期实 践、配伍，各师各法，创造出多式多样的“凉茶”，逐渐 成为岭南文化的代表之一 [9]。本实验研究的凉茶为彭康 教授在临床上针对岭南地区特殊环境和当地居民的体质， 用以祛暑解表、清热化湿的经验方，该方是在《温病条 辨》中新加香薷饮的基础上进行加减 [10]，用白茅根清热 解毒、夏枯草清肝明目、藿香醒脾化湿开胃、甘草补脾 并调和诸药，制成具有清热祛湿、补脾开胃的保健凉茶。 本凉茶在本院已有较长的使用历史，作为消暑佳品受到 广大病友和师生的欢迎。本研究拟通过复制脾胃湿热证 动物模型，进一步明确清热祛湿凉茶的治疗效果并探讨 其作用机制，为其临床运用提供理论依据。 1　材料 1.1　试药 　　清热祛湿凉茶组方：白茅根、夏枯草各 10 g，香 薷、藿香各 5 g、生甘草 3 g（南方医科大学中西医结 合医院中药房），将药材在水中浸泡 20 min，以武火 煎煮至药液沸腾后改为文火，保持沸腾状态，继续煎 煮 20 min，用洁净纱布滤取煎液。随后加水复煎一次， 两次煎液混匀后浓缩至 1 g·mL － 1 ，于 4℃冰箱保存 备用。按照《中药药理研究方法学》人、大鼠剂量转换 公式（大鼠按 200 g 体重计算）[11]，计算大鼠的低、中、 高给药剂量为 1、3 和 9 g·kg － 1 。 1.2　动物和饲料 　　 健 康 SPF 级 SD 大 鼠 40 只， 雄 性，200 g 左 右 [ 济 南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证：SYXK（鲁） 20140007]。基础和高脂高糖饲料（80% 基础饲料＋ 12% 猪油＋ 8% 蜂蜜），均由南方医科大学实验动物中心提供。 1.3　菌种及试剂 　　鼠伤寒沙门氏菌（浓度 1.38×109 cfu·mL－ 1 ，广东 省微生物研究所，菌种编号：CMCC50115）。超氧化物 歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和一氧化氮（NO）检 测试剂盒（批号：20170807，南京建成生物工程研究所）。 核转录因子 2E2 相关因子 2（Nrf2）抗体（批号：Lot GR3201022-1，英国 Abcam 公司）和血红素氧合酶1（HO1，批号：Lot C0716，美国 Santa Cruz 生物技术公司）。 2　方法 2.1　动物分组及造模方法 　　将 40 只 SD 大鼠适应性喂养 5 d，称重，随机分 为 5 组：正常对照组，脾胃湿热证模型组，清热祛湿 凉茶高剂量、中剂量、低剂量，每组 8 只。 　　造模动物于造模前禁食 12 h，自由饮水。正常对 照大鼠在 25℃、35% ～ 75% 的温湿度自然环境下， 以基础饲料喂养 26 d。模型组：采用高脂高糖饮食＋ 人工热气候模拟仓 [ 环境设置为：温度为（33±2）℃， 相对湿度（80±5）%，每日上午 9 时至下午 3 时 ] ＋ 生物致病因子（每日灌胃一次 1×109 cfu·mL－ 1 鼠伤 寒沙门氏菌 1 mL/100 g，连续灌胃 2 d）造成脾胃湿热 证模型。药物干预组：在造模成功后，给予高、中、 低剂量清热祛湿凉茶，每日 2 次，连续灌胃 1 周。具 体时间流程见图 1。 2.2　一般情况观察 　　观察大鼠一般生理状况如精神状态、皮毛色泽、 活动度、大便性状等。于造模前，造模第 5、10、17、 19、23 和 26 日测定大鼠肛温和体重、每组食量（每日 投放量－每日剩余量＝每日食量）、饮水量（每日投放 量－每日剩余量＝每日饮水量）。 2.3　血清生化指标检测末次给药后，各组大鼠禁食 12 h，不禁水。麻醉 大鼠，开腹腔，下腔静脉采血 8 mL，静置 30 min 后以 3000 r·min－ 1 离心 10 min，取上层血清置于 EP 管中。 按照试剂盒说明书检测血清中 NO（硝酸还原酶法）、 SOD（WST-1 法）和 MDA（硫代巴比妥酸法）的含量， 同时将部分血清送至医院检验科检测血糖和血脂情况。 2.4　胃、结肠和舌黏膜组织病理检测 　　取胃窦、结肠和舌黏膜组织，置于 4% 多聚甲醛 中，固定过夜，依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋等 步骤制作成蜡块，切片后 HE 染色。显微镜下观察胃、 结肠和舌黏膜炎症情况。 2.5 Western blot 方法分析结肠中核蛋白 Nrf2 和总蛋 白 HO-1 的表达水平 　　取“2.4”项下部分新鲜结肠组织，采用细胞核蛋白 和组织蛋白提取试剂盒分别提取核蛋白和总蛋白。将 上述蛋白提取液按 4∶1 加入 5×SDS 蛋白上样缓冲液， 混匀后于金属浴中 100℃煮沸 15 min 进行蛋白变性， 于冰上冷却后，用 BCA 法进行蛋白定量。从 4℃冰箱 中取出制好的凝胶，固定好后，加入足够体积的 1× 电泳缓冲液后，根据蛋白总量一定原则计算的体积进 行上样，开始电泳。而后转印于 PVDF 膜上，置于 5% 脱脂牛奶，室温封闭 2 h。TBST 缓冲液洗涤 3 次，分 别置于相应的一抗，4℃摇床孵育过夜。次日，TBST 洗涤 3 次，于相应二抗中室温孵育 2 h，再用 TBST 洗 涤 3 次，ECL 化学发光显影，Image J 软件分析灰度值。 2.6　统计学方法 　　采用 SPSS 20.0 统计软件对原始数据录入和分析 处理，计量资料用均数 ± 标准差进行数据的统计描 述，数据比较采用 One-way ANOVA 分析，P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。 3　结果 3.1　大鼠一般状况 　　正常组大鼠精神状态好，皮毛有光泽，反应灵敏， 活动自如，大便自如。而模型组大鼠随着造模时间的 推移，出现嗜睡懒动，皮毛无光泽，反应迟钝，大便 溏腻等表现。清热祛湿凉茶组大鼠在给药一段时间后 上述症状逐渐改善。 3.2　清热祛湿凉茶对脾胃湿热证大鼠体重、饮食量和 饮水量的影响（见图 2） 　　正常组大鼠摄食和饮水量均衡增加，体重呈进行 性增长，而模型组和清热祛湿凉茶组大鼠在造模过程 中，饮食量呈进行性减少趋势，体重增长缓慢，但差 异无统计学意义（P ＞ 0.05，见图 2）。

3.3　清热祛湿凉茶对脾胃湿热证大鼠肛温的影响 　　正常组大鼠肛温在实验过程中无明显变化。模型组和 清热祛湿凉茶组大鼠随着造模进行，肛温持续上升。在 经过造模第一阶段的高脂高糖喂养后，模型组大鼠的肛 温与正常组差异具有统计学意义（P ＜ 0.01，P ＜ 0.001）， 灌胃伤寒沙门氏菌后，模型组大鼠肛温达到最高值。经过 凉茶干预后，与模型组相比，高、中、低剂量组大鼠肛温 显著下降（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）（见图 3）。 3.4　清热祛湿凉茶对脾胃湿热证大鼠血脂、血糖以及 血清中 NO、SOD 和 MDA 的影响 　　与正常组相比，模型组大鼠血清中 TC 和 TG 含量 显著升高（P ＜ 0.001），经过凉茶干预后，TC 和 TG 的含量呈下降趋势，尤以高剂量组效果最好，差异有 统计学意义（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01），见图 4。 　　与正常组比较，模型组大鼠血清中 NO 和 SOD 含量 显著下降，MDA 水平显著升高，差异均具有统计学意义 （P ＜ 0.001）。与模型组比较，低、中、高剂量组均能提 高血清中 NO 水平，差异均具有统计学意义（P ＜ 0.05）； 血清中 SOD 水平呈上升趋势，但只有高剂量组与模型组 比较差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）；中、高剂量组大 鼠 MDA 含量较模型组下降明显（P ＜ 0.001），且治疗效 果较低剂量差异具有统计学意义（P ＜ 0.01）（见表 1）。 3.5　清热祛湿凉茶对脾胃湿热证大鼠结肠、舌和胃组 织病理形态学影响大体标本观察：各组均未见明显胃肠道黏膜的上皮 出血、溃疡、糜烂和坏死等改变。由 HE 染色可见，正常组大鼠胃黏膜结构完整，结肠绒毛排列紧密，柱状上 皮细胞排列整齐，舌固有层有轻度淋巴细胞浸润，组织 无明显疏松水肿，肌层无充血水肿，无腺管扩张（见图 5A ～ C）。脾胃湿热证模型大鼠结肠黏膜充血水肿，上 皮细胞中等脱落、坏死，间质可见明显炎症细胞浸润（见 图 5D）。舌固有层可见中度淋巴细胞、嗜酸性细胞浸润， 组织疏松，肌层可见充血水肿（见图 5E）。胃黏膜组织充 血水肿，固有层和黏膜下层可见明显中性粒细胞、嗜酸 性粒细胞浸润（见图 5F）。经过凉茶干预后，高、中、低 剂量组与模型组比较，结肠上皮细胞排列整齐，固有层 散在炎细胞浸润，胃黏膜结构清楚，舌固有层有轻度淋 巴细胞浸润，肌层无明显病理改变（见图 5G ～ O）。3.6　清热祛湿凉茶脾胃湿热证大鼠结肠组织中 Nrf2 和 HO-1 蛋白表达影响 　　与正常组相比，模型组大鼠结肠组织中的 Nrf2 和 HO-1 表达显著增加（P ＜ 0.001）。与模型组相比，中、 高剂量组结肠组织中的 Nrf2 表达增加，差异具有统计 学意义（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）；凉茶干预后，结肠中 HO-1 的表达呈升高趋势，在高剂量组与低、中剂量组 比较差异具有统计学意义（P ＜ 0.01），见图 6。　讨论 　　中医动物模型是依据中医病因病机论，利用特定 的致病因素，在动物中复制出于人类疾病和病理改变 相同或相似的症候，建立科学合理的中医动物模型是 研究中医病证本质和评估中医药治疗手段的重要环节 之一 [12]。脾胃湿热证是湿热证中最常见和多发的类型， 也是具有岭南地区特色的中医病证之一，其标准和规 范的动物模型对于研究脾胃湿热证具有重要意义。脾 胃湿热证动物模型是在遵循湿热证“外湿引动内湿”的 基础上，从临床角度和病证结合出发，更强调脾胃功 能的失调。本研究在文小敏等 [13-14] 研究基础上，采用 高脂高糖饮食＋湿热环境＋伤寒沙门氏菌的综合因素 模拟“内外合邪”，结果显示模型组大鼠较好的复制了 脾胃湿热证的症状体征。 　　随着现代医学研究发展，对脾胃湿热证的本质研 究越来越以多层次和多角度来探讨。目前研究表明， 脾胃湿热证的病因病机与免疫学的分子调控机制 [15]、 水液代谢 [16]、神经内分泌系统 [13，17]、微生物 [18] 和细 胞凋亡 [19] 等因素有关。越来越多的体内外实验研究表 明，氧化应激在脾胃湿热证的发生、发展过程中扮演 非常重要的角色。ROS 被认为是造成氧化应激的主要 原因，本研究中模型组大鼠的血脂水平显著上升，而 已有大量研究表明高血脂状态被认为是脂质过氧化物 和自由基产生的主要诱因。中医学的脾胃与人体免疫 功能有关，脾胃湿热证在临床上往往表现胃肠系统的 炎症反应如黏膜水肿、糜烂、便血等炎症改变，而炎 症反应能引起氧化应激。以上因素破坏了机体氧化 - 抗氧化系统之间的平衡，消耗大量抗氧化物质，生成 过多 ROS，而 ROS 增多能够继续激活氧化通路，使 氧化损伤不断扩大。在本研究中作者发现脾胃湿热证 动物体内的抗氧化物质如 SOD 和 NO 显著下降，而 MDA 等脂质过氧化产物则显著升高，与相关文献报 道一致 [14，20-21]。 　　Nrf2 作为体内抗氧化机制的关键信号，氧化应激 时，被激活后解离释放进入细胞核，参与调控具有细 胞保护效应的多种抗氧化酶基因（如 HO-1）的转录， 从而达到减轻炎症反应，降低氧化应激水平，达到保 护细胞和组织的作用。在研究中，作者发现脾胃湿热 模型组的 Nrf2 和 HO-1 蛋白表达水平较正常组显著上 调，这是机体在氧化应激条件下反馈性的自身保护效 应 [22]，同时也证明了脾胃湿热证这种疾病能够生成 ROS，导致氧化损伤，并能激活 Nrf2/HO-1 抗氧化应 激通路。随后，作者探讨了清热祛湿凉茶是否能通过 干预这一信号通路达到保护作用。结果表明，经过药 物干预后，Nrf2 和 HO-1 被持续激活，其表达较模型 组有明显上升趋势，在高剂量时差异具有统计学意义。 　　凉茶在我国尤其是岭南炎热湿润地区被广泛用来 改善群众生活中“上火”等不适感觉。已有研究表明 “上火”是一种体内复杂的应激负荷反应过程 [23]。该 过程通过激活下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴（HPA 轴），增 加皮质醇类激素释放，引起氧化应激损伤，打破氧化 和还原平衡。因此“上火”与体内氧化应激损伤密切相 关。已有研究表明广东凉茶具有一定的抗氧化活性 [24]， 本研究的清热祛湿凉茶配方中的白茅根、夏枯草、香 薷等中药是广东凉茶较常用的原料。白茅根又称甜草 根，由于其具有凉血止血、清热生津的作用，在许多 保健食品中尤其是凉茶中应用广泛。有文献报道白茅 根多糖对 ABTS 自由基有较好的清除作用，同时对α葡萄糖苷酶有一定的抑制作用 [25]；白茅根总黄酮对 DPHH 自由基具有一定的清除能力 [26]。夏枯草的抗氧 化活性与其含有的黄酮和多糖类成分有关。研究表明 夏枯草中的黄酮、多糖等成分具有显著的自由基清除 能力 [27]，且相关研究提示黄酮可能是其主要抗氧化活 性物质 [28]。其他组分包括广藿香、香薷等都已有文献 报道其活性部位具有一定的抗氧化活性 [29-30]。 　　综上所述，脾胃湿热证与氧化应激之间关系密切， 清热祛湿凉茶能够通过清除 ROS，降低氧化应激水平 来达到治疗效果，其作用机制可能与激活 Nrf2/HO-1 信号通路有关。清热祛湿凉茶抗氧化的物质基础值得 进一步的研究和探讨。

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